先前通过全外显子组测序（WES）或靶向基因测序（TPS）进行的分子图谱研究显示，BTC患者存在反复的基因组变异。IDH1/2、FGFR1/2/3、EphA2和BAP1基因突变主要出现在ICC中；而KRAS、ARID1B、ELF3和PBRM1突变则多出现于ECC中；TP53和ERBBs在GBC中较常出现突变。此外，根据早期临床试验观察，个性化的分子靶向治疗已成为治疗难治性BTC患者的一种有希望的策略。然而，当前对不同人群导致不同基因型和分子表型的致病因素知之甚少，需要更多的基因组数据和临床实践来揭示基因突变对晚期BTC患者的预后或预测意义。

为了确定具有临床转化意义的潜在基因组靶点，北京协和医院肝脏外科赵海涛、北京协和医学院基础医学研究所王晓月课题组和至本医疗科技（上海）有限公司联合对803例中国BTC患者的基因组图谱进行了全面分析，系统地描述了BTC患者的体细胞突变谱和种系变异，并研究了它们与个性化分子靶向治疗的病因背景、预后和治疗反应之间的联系。该研究成果以题为“Mutational spectrum and precision oncology for biliary tract carcinoma”发表在Theranostics（IF=8.58）上。

首先，研究者分析了803例BTC患者（475例ICC，164例ECC和164例GBC）的基因组图谱，共鉴定了27,042个体细胞单核苷酸变异（SNVs）和15,425个小的插入缺失突变（图1）。通过WES和TPS对31个肿瘤样本的子集进行测序，在不同模式之间识别的变异等位基因型比例（VAF）实现了极好的一致性（R²=0.81）；在基因水平上，WES和TPS之间的拷贝数变异（CNV）高度一致。接下来，研究者对整个队列的肿瘤突变负荷（TMB）进行评估，结果显示TMB中位数为1.23Mut/Mb，BTCs超突变率为4.1%。之后，研究者使用MutSigCV，共检测到37个显著突变基因（SMGs），此外，还在803个肿瘤样本系列中搜索了68个假定的BTC癌驱动基因的体细胞变异。其中突变频率最高的基因是TP53、KRAS、ARID1A和LRP1B；值得注意的是，IDH1和IDH2突变在西方人群胆管癌（CCA）患者中很常见（25%），而在中国BTC患者中分别只有7%和2%；在9%的BTC患者中检测到KMT2C的突变，这表明这些患者中的一部分表现出组蛋白甲基酶和去甲基酶的异常。

图1. 803例BTC患者基因组突变谱分析

图片来源：Theranostics

为了描述重要的CNV事件，研究者使用WES数据对肿瘤组织和正常组织进行GISTIC2分析，显示出129个局灶性染色体扩增和111个局灶性染色体缺失，且观察到已知癌基因的显著扩增和抑癌基因的缺失。研究者分析了803例BTC中CNV驱动突变的群体频率，最常见的扩增癌基因是CCND1（6.97%），其次是MET（6.72%），MDM2（6.6%）和ERBB2（5.85%），而主要的抑癌基因是CDKN2A（5.73%）和CDKN2B（5.35%）。接下来，将这些基因组突变与BTC队列中的临床特征联系起来，TP53突变在GBC患者中更为常；KRAS突变在晚期BTC（III-IV期）和ECC患者中更为丰富；ICC患者更常携带IDH1和PBRM1突变，以及MYC和MDM2扩增。此外，研究显示高突变肿瘤中的13个基因，包括KMT2D、FAT3/4和几个DNA损伤修复（DDR）基因在突变频率上有显著差异（图2）。

图2. 推测的致癌基因中染色体体细胞拷贝数变异的鉴定

DDR突变体代表了一些肿瘤存在DDR基因的零星突变，DDR缺陷是BTC的一个标志，研究者通过评估DDR基因突变的普遍性，以深入了解队列中的基因。考虑到大多数DDR基因在BTCs中是否具有致癌作用以及WES和TPS之间的共靶向基因库尚未确定，研究者在整个队列中估计了涉及TP53的47个DDR基因，涵盖了8种主要的功能性DDR通路。结果显示65.5%（526/803）的BTC患者存在DDR突变，其中284例为TP53突变，且在三种不同的BTC亚型中，TP53是最常见的DDR基因突变；而在242例非TP53 DDR突变患者中，最常见的DDR基因是ATM，BRCA2，PRKDC，ATR和POLE。因此，在不同的BTC亚型中，DDR基因突变患者的TMB明显高于野生型DDR基因患者。接下来，研究者通过计算预测方法，结合人工校准，发现在803例患者中，有96例（12%）携带致病性或潜在致病性种系突变，均为杂合子突变。研究结果表明，BTC患者中涉及PRSS1和SPINK1的慢性遗传性胰腺炎和胰腺癌发生的遗传易感性与种系突变的易感性相关，且种系中PRSS1基因的功能获得突变和SPINK1基因的功能丧失突变在BTC患者中普遍存在（图3）。 

图3. DDR突变体和种系突变体的鉴定

图片来源：Theranostics

BTC患者的各种病因可能指向不同的单碱基替换（SBSs）体细胞突变特征。目前队列中的大多数WES数据来自ICC患者，研究者使用非负矩阵分解（NMF）分析来提取ICC中SBSs的突变特征。NMF分析揭示了3个独特的特征：特征A，具有C>T的主导模式；特征B，以A : T>T : A转换为主导；特征C，没有主导的SBS模式。接下来，将这三个特征与COSMIC数据库中人类癌症的SBS特征进行了比较，结果显示，35.8%的ICC具有马兜铃酸（AA）相关的突变特征和升高的TMB，这表明AA暴露可能导致胆管癌中DNA损伤和体细胞突变的积累。之后，研究者对有WES数据的患者进行生存分析，以全面评估ICC中这些突变的预后意义，结果显示TP53和KRAS突变和7q31.2扩增与较差的预后相关（图4）。 

图4. ICC的突变特征分析和预后改变

将基因组突变转化为与临床治疗的靶点对于靶向治疗具有重要意义。该项研究中，研究者根据OncoKB或ESCAT的分类定义了19个基因作为BTC中的潜在治疗靶点（PATs），有25.4％患者携带这些PATs，其中ECC亚型患者中携带PAT的比例最低。在有携带PATs的人群中，鉴定出源于SCNA的PATs，包括MET（29.3%）、ERBB2（29.3%）和CDK4（11.5%）。此外，研究者还调查了643名患者的体细胞融合起源的PATs，发现4%（26/643）的患者存在FGFR2/3融合，而在6名患者中检测到零星的NTRK1/3融合，这表明拉洛替尼的有效治疗可能只适用于~1%的BTC患者。dMMR肿瘤对免疫检查点阻断（ICB）靶向PD1/PDL1治疗高度敏感，与肿瘤组织来源无关，在该研究队列中，只有1.2%的BTC患者有微卫星高不稳定性（MSI-H）状态，这表明ICB系统治疗仅对一小部分晚期BTC患者有效。总体而言，在BTC患者中发现的大多数PATs的临床证据并不充分。最后，研究人员对46例难治性BTC患者进行了个性化的靶向治疗，结果显示客观缓解率（ORR）为26.1%；无恶化生存期（PFS）的中位数为5.0个月，21名患者的PFS2/PFS1比例大于1.3，说明他们从治疗中获益。总体而言，以上数据表明，对于侵袭性、转移性和难治性BTC患者来说，个性化的精确靶向治疗是很有前途的。根据ESCAT和OncoKB的循证建议，这19个PAT基因可能有助于BTC患者的转化精准肿瘤学的进一步个性化选择（图5）。

图5. BTC患者的潜在可操作靶点和生物标记物引导的靶向治疗

图片来源：Theranostics

综上所述，该研究报告了803例BTC患者的基因组突变图谱，在BTC患者中观察到广泛的基因组多样性和异质性，这与潜在的病因暴露、解剖亚型和临床病理特征有关。研究提供了一种可行的，转化基因组驱动的肿瘤精准医学策略，目前的研究结果虽然不是决定性的，但表明对PAT的定义确实是在晚期BTC患者中确定个性化治疗的有效方法。